Rezultati nakon prve godine rada

 

U početku istraživanja nastojali smo pronaći peptid koji će zadovoljavati dva bitna uvjeta: (1) on mora biti dovoljno malen da računi na GRID–u budu izvedivi i (2) rezultati trebaju biti ne samo interesantni sami za sebe, nego i imati znanstvenu relevantnost i potencijalnu primjenu. Pronašli smo da oba ova uvjeta zadovoljava Met-enkefalin (slika 1) koji se satoji od 5 alfa–aminokiselina povezanih u sekvencu Tyr–Gly–Gly–Phe–Met. Met–enkefalin spada u endogene opioidne peptide koji su odgovorni za različite fiziološke procese, od kojih je najbolje opisana analgezija.

 

Slika 1.

 

NMR ekperimenti pokazali su da taj pentapeptid u vodenoj otopini zauzima niz različitih konformacija, odnosno nema strogo definiranu strukturu. U jednom od nedavnih teorijskih istraživanja opisan je profil potecijane energije za molekulu Met–enkefalina. Korištena je metoda molekularne dinamike s ''ff94'' parametrima polja sila i uz eksplicitni model otapala. Pokazano je da Met–enkefalin zauzima niz tipičnih konformacija, među kojima dominira struktura alfa–uzvojnice. Neka kasnija istraživanja pokazala su da ''ff94'' parametri polja sila favoriziraju strukturu alfa–uzvojnice, pa je to dovelo u pitanje pouzdanost prethodnih rezultata. Odlučili smo testirati različite parametre polja sila, te ispitati njihov utjecaj na strukturu Met–enkefalina.

 

Simulacije Met-enkefalina uz korištenje implicitnog modela otapala

Za svaki skup parametara polja sila (ff94, ff99, ff03) napravili smo simulaciju svijanja pentapeptida uz implicitni model otapala, u trajanju od 150 ns pri temperaturi od 300K, a vremenski interval za numeričku integraciju iznosio je 2 fs. Strukture dobivene ovim simulacijama grupirane su i podvrgnute tzv. clustering analizi, s promjerom klastera od 2 Ĺ. Za vizualno predstavljanje rezultata korištene su glavne komponente (vlastiti vektori matrice kovarijance), i set podataka je projiciran na prve dvije glavne osi (vlastiti vektori povezani sa dvije najniže vlastite vrijednosti, koje bi trebale ''uhvatiti'' glavninu varijacije). Ovakva projekcija omogućava dvodimenzionalni prikaz podataka kao što je ovaj na slici 2. 

 

Slika 2.

 

Na slici možemo vidjeti da postoje setovi klasterirani u zasebnim područjima ukupnog faznog prostora. Bojama je predstavljena povezanost tih područja sa različitim oblicima peptidne okosnice Met–enkefalina, koji predstavljaju centroid (prosječnu strukturu) svakog od klastera. Postoci ispod svake strukture govore koliki je udio pojedinog centroida u ukupnom ansamblu. Rezultati napravljeni sa ff94 poljem sila pokazuju da je gotovo 50% struktura u obliku alfa–uzvojnice (klaster 2). Preostale strukture se mogu svrstati u dvije skupine: a) kvazi–helikoidalna (klaster 1), i b) beta–okret (klaster 3). Dobiveni rezultati u skladu su s rezultatima starijih istraživanja.

Ista simulacija na Met–enkefalinu provedena je s parametrima polja sila ff99. Parametri polja sila ff99 vrlo su slični parametrima polja sila ff94, osim razlike u vrijednostima torzijskih kuteva. Ove su razlike uvedene da bi se izbjeglo pretjerano stabiliziranje helikoidnih struktura.

 

Slika 3.

 

Na slici 3 se vidi da je udio helikoidnih struktura (klaster 2) smanjen na 27%. Ovdje dominiraju konformacije koje pripadaju klasteru 3 (izobličeni beta–okret). Kvazi–helikoidne konformacije (klaster 1) zastupljene su u još manjoj mjeri, a pojavljuje se i veoma mala frakcija lijevih uzvojnica (klaster 4).

Nedavno su razvijeni najnoviji parametri polja sila za simulaciju proteina, ff03. Oni uključuju nešto točnije vrijednosti atomskih naboja, kao i temeljitiji pristup vrijednostima torzijskih kuteva. Nedavno izvedeni testovi pokazali su da ff03 pruža mnogo uravnoteženiji opis različitih konformacija. To je vidljivo i na slici 4. Ohrabrujuće je što je raspodjela struktura u dobrom slaganju s rezultatima dobivenim uz ff99. Pored nepreciznosti u parametrima polja sila, mogući izvor pogreške u dosad opisanim simulacijama predstavlja i implicitni karakter otapala. Nedavni rad od Zhou-a pokazuje da čak i s korigiranim vrijednostima torzijskih kuteva, upotreba modela implicitnog otapala rezultira pretjeranom stabilizacijom određenih konformacija, naročito (ponovno) alfa–uzvojnica.

 

 

Simulacije Met–enkefalina uz korištenje eksplicitnog modela otapala

Nakon što smo odabrali ff03 kao najuravnoteženije parametre polja sila, stavili smo Met–enkefalin u periodičnu kutiju (periodic box) sa 634 TIP3P molekule vode. Simulacije je provedena u trajanju od 40 ns i konformacije peptida su analizirane kao i prije.

 

Slika 4.

 

Iz slike 4 primjetno je da su projekcije glavnih komponenti mnogo jače raspršene nego što je to bio slučaj u simulacijama s implicitnim modelom. U takvoj situaciji multidimenzionalna klasterska analiza postaje proizvoljnija, budući da svaki klaster pokriva puno veće područje u grafu, a time i veći broj različitih struktura. Bez obzira na to, ponovo je upotrijebljena ista analiza i klasteri su označeni istim bojama kao i u slučaju simulacije sa implicitnim modelom otapala. Kao što se može vidjeti, klaster 2 (zeleni) sadrži vrlo malo helikoidalnih struktura i bolje ga je klasificirati kao istegnutu (extended) strukturu. Beta–okret još uvijek postoji, ali su strukturne varijacije u tom klasteru ogromne. Centroid trećeg klastera je također istegnut, što znači da je i kod njega prisutna značajna strukturna varijacija. Možemo zaključiti da 40 ns simulacija u eksplicitnom modelu otapala ne favorizira nijednu strukturu, bez obzira na to što je drugi klaster prilično jako zastupljen (27%).

            Simulacije sa eksplicitnim otapalom povezane su sa nekoliko problema. Jedan od njih je taj da troše izuzetno puno kompjuterskog vremena. Drugi problem povezan je s činjenicom da se određena konformacija ''zaglavi'' u jednom od minimuma na plohi potencijalne energije, jer je barijera za prijelaz u drugu konformaciju znatno veća nego što je to dostupno pri temperaturi od 300K. Novo rješenje ovog problema je tzv. 'replica exchange molecular dynamics' metoda. Taj pristup zasniva se na paralelnom izvođenju višestrukih simulacija ili replika na istom sustavu, ali na različitim temperaturama. Pojedine simulacije zamjenjuju temperature u određenim vremenskim intervalima, pri čemu moraju biti zadovoljeni neki uvjeti (Monte Carlo). To omogućava svakoj trajektoriji da provede određeno vrijeme na svakoj od temperatura definiranih u nekom opsegu na početku simulacije, npr. 275-425K, i na taj način  preskoči većinu potencijalnih barijera. Iz simulacije se na kraju izdvajaju samo podaci za relevantnu temperaturu, npr. za 300K. Na taj način, umjesto jedne simulacije od 40 ns moguće je napraviti simulaciju sa 16 replika, od kojih svaka traje po 2.5 ns. Primjer temperaturne varijacije za dvije replike (od 16) u jednoj takvoj simulaciji prikazan je na slici 5.

 

 

Slika 5.

 

Slika 6.

 

Konformacijska analiza svih 16 replika predstavljena je na slici 6. Tri klastera su približno jednako zastupljena. To potvrđuje gore navedeni zaključak, koji je dobiven na osnovi jedne simulacije u trajanju od 40 ns, a koji kaže da Met-enkefalin u vodi može poprimiti niz različitih struktura, svaku sa istom vjerojatnošću.

            Iako se replica exchange metoda u posljednje dvije godine pokazala jako dobrom za ispitivanje svijanja proteina male i srednje veličine, ona je inherentno paralelna metoda i zahtijeva paralelne kompjutere. U situaciji kad takvi resursi nisu dostupni potrebno je pronaći alternativni pristup. Mi smo odlučili razviti jednu takvu metodu, zasnovanu na neinteragirajućim replikama. Osnovni princip metode je da se provede jedna kratka (1ns) simulacija peptida u eksplicitnom modelu otapala pri 800K. Nakon toga se napravi klasterska analiza, tako što se proizvede određeni broj klastera  (npr. 8). Strukture najbliže centroidu svakog klastera se zatim uzimaju kao polazne strukture za osam simulacija na 300K, od kojih svaka traje po 5 ns (tj. ukupno vrijeme simulacije je 40 ns). Osnovna ideja ove procedure jest pokušaj generiranja osam vrlo različitih početnih struktura, i time povećanje šanse pokrivanja cijelog konformacijskog prostora u simulaciji. Na slici 8 je prikazana konformacijska analiza jedne takve simulacije. Slaganje s mnogo sofisticiranijom replica exchange metodom je vrlo ohrabrujuće.